P요소

P element

P 원소잡종 이질이라고 불리는 유전 형질의 원인 물질로 드로필라에서 발견된 전이성 원소다. Transposon은 P 원소의 P 형질을 담당하며 야생 파리에서만 발견된다. 그들은 또한 많은 다른 진핵생물에서도 발견된다.[1]

P 원소는 P transposase라고 알려진 효소를 위해 인코딩된다. 실험실에서 기른 암컷과 달리 야생형 암컷은 매우 동일한 원소에서 생성되는 P transposase 함수에 대한 억제제를 나타내는 것으로도 생각된다. 이 억제제는 P 원소의 이동으로 인한 게놈의 교란을 줄여 비옥한 생식을 가능하게 한다. 이에 대한 증거는 실험용 암컷(P transposase 억제제 부족)과 야생형 수컷(P 원소를 가지고 있음)의 교차점에서 나온다. 억제제가 없을 때 P 원소는 게놈 전체에서 증식할 수 있어 많은 유전자를 교란시키고 종종 생식이나 멸균에 치명적인 것으로 판명된다.

P 원소는 드로소필라와 함께 하는 유전자 실험에서 돌연변이 유발 물질로 흔히 사용된다. 이 접근 방식의 한 가지 장점은 돌연변이를 찾기 쉽다는 것이다. 잡종 이질에서는 드로소필라의 한 변종이 다른 종류의 드로소필라와 짝짓기를 하여 잡종 자손을 낳고 이질이라고 알려진 염색체 손상을 일으킨다. 잡종 이질병은 양쪽 부모 모두의 기여를 필요로 한다. 예를 들어 P형 변종이 아버지적으로 기여하고 M형 변종이 어머니적으로 기여하는 P-M형 시스템에서 이질균이 발생할 수 있다. M 세포형 아버지와 P 어머니가 있는 역십자는 P x P 또는 M x M 방식으로 교차하면서 정상적인 자손을 낳는다. P 수컷 염색체들은 M 암컷과 교차했을 때 이질을 일으킬 수 있다.

특성.

P 원소는 2급 트랜스포손이며, DNA 기반의 "절단과 붙여넣기" 메커니즘에 의해 움직인다. 인식 순서는 3개의 인트로 분리된 4개의 엑손으로 구성된다.[2] 인트론의 완전한 스플리싱은 트랜스포세아제 효소를 생성하는 반면, 인트론 1과 2의 대체 부분 스플리싱은 mRNA 대본에 인트론 3만 남겨두면 P요소 압착기를 인코딩한다. 완전하고 자율적인 P 원소는 전이효소 효소를 인코딩하는데, 효소는 P 원소의 양쪽 끝에서 반전된 31bp 단자를 인식하고 P 원소 절제와 재삽입에 촉매 작용을 한다. 전체 원소의 길이는 2,907 bp이다. 비자율 P 원소들은 다양한 길이의 내부 삭제를 포함하고 있어 트랜스포제 생산을 폐지하지만, 기능성 트랜스포세제가 게놈의 다른 곳에 암호화되어 있다면 그러한 원소들은 여전히 동원될 수 있다. P 요소 삽입과 후속 절제는 반드시 절연 부위에서 8-bp 직접 반복을 남겨두기 때문에 그러한 반복이 존재한다는 것은 이전의 P 요소 활동을 나타낸다.

모든 P 요소는 31-bp 단자 반전 반복측정 및 11-bp 내부 반전 반복측정기가 포함된 표준 구조를 가지고 있다. 가장 짧고 긴 P 원소는 비자율 원소다. 가장 긴 P 요소는 전치에 필요한 전이효소를 인코딩한다. 트랜스포세스를 암호화하는 순서와 같은 순서는 세포가 발달하는 동안 세포질 내에 축적되는 전이 억제기도 암호화하고 있다. 따라서 P나 M 수컷과 P 암컷의 교차점에서 암컷 세포질은 억제기를 포함하고 있는데, 억제기는 어떤 P 원소에도 결합하여 그들의 전이를 방지한다.

잡종 이질균

하이브리드 이질화란 자율 P원소(P 스트레인/P 세포형)를 가진 수컷과 P원소가 부족한 암컷(M 스트레인/M 세포형)의 교차에서 발생하는 드로필라 균주의 세균선 세포의 돌연변이 비율이 높은 것을 말한다. 하이브리드 이질성 증후군은 온도에 따른 불임성, 높은 돌연변이율, 염색체 재배열 및 재조합 증가 등으로 나타난다.

잡종 이질체 표현형은 M형 변종 암컷을 가진 P형 변종 수컷의 자손의 생식선 세포 에서 P 원소의 전위작용에 영향을 받는다. 전이(transposase mRNA)를 만드는 데 필요한 스플라이싱(spplicing) 현상이 체세포에서는 발생하지 않기 때문에 전이(transposase) mRNA를 만드는 데 필요한 스플라이싱(spplacing) 현상이 세균선 세포

잡종 이질균은 P 변형된 수컷과 M 변형된 암컷을 교차할 때 나타나며, M 변형된 수컷과 P 변형된 암컷(자율적인 P 원소를 가진 암컷)을 교차할 때 나타나지 않는다. P형 변종 암컷의 알에는 전이효소 유전자의 전사를 막는 억제 단백질이 다량 함유되어 있다. 억제 단백질을 함유하지 않은 M형 변종모양의 난자는 아버지의 정자로부터 P 원소를 전치할 수 있게 한다. P형 여성에서 억제기는 세포질에서 발견된다. 따라서 P형 수컷이 M형 암컷을 수정하면(그 중 세포질에는 억제제가 들어 있지 않은 경우), 수컷은 P형 유전자로 이어지는 수컷 세포질에는 기여하지 않는다.[2]

이 효과는 P 요소에 대한 방어 메커니즘을 제공하는 모계 라인에서만 PIRNA가 유전되는 데 기여한다.[3]

분자생물학에서 사용

P 원소는 드로소필라 연구에서 돌연변이 물질로서 광범위하게 사용된다는 것을 발견했다. 돌연변이 유발 시스템은 일반적으로 자율적이지만 움직이지 않는 요소와 이동 가능한 비자율 요소를 사용한다. 이후 세대의 파리들은 표현형이나 PCR에 의해 선별될 수 있다. 자연발생 P원소에는 효소전달효소에 대한 코딩순서와 전이작용에 대한 인식순서가 포함되어 있다. Transposase는 숙주 DNA에서 P 원소의 분리를 조절하고 촉매하여 두 개의 인식 부위에서 절단한 다음 무작위로 재삽입한다. 유전자 연구에 사용될 수 있는 것은 기존 유전자를 방해하거나 추가 유전자를 지니고 있을 수 있는 무작위 삽입이다.

이것을 유용하고 통제 가능한 유전 도구로 사용하기 위해서는 P 원소의 두 부분을 분리하여 제어되지 않는 전이를 방지해야 한다. 일반적인 유전적 도구는 삽입할 수 없는 전이효소 인식 시퀀스가 없는 전이효소에 대한 DNA 코딩과 "P 플라스미드"이다. P 플라스미드는 항상 드로소필라 리포터 유전자, 종종 적목현상(흰색 유전자의 산물), 트랜스포세 인식 시퀀스를 포함한다. 그들은 관심 유전자, 대장균 선택 가능한 표식 유전자, 종종 어떤 종류의 항생제 내성, 복제의 기원 또는 기타 연관된 플라스미드 "하우스 키핑" 시퀀스를 포함할 수 있다.

사용방법

이러한 도구를 활용하는 두 가지 주요 방법이 있다.

플라이 변환

  1. P 원소를 플라스미드로 복제하고 이것을 박테리아에서 변형하여 배양한다.
  2. P transposase를 제거하고 관심 유전자로 대체하십시오.
  3. 초기 단계(전세포화) 배아의 후단부를 전이효소에 대한 DNA 코딩과 리포터 유전자와 관심 유전자, 전이효소 인식 시퀀스를 가진 플라스미드로 미세 주입한다.
  4. 관심 유전자와 리포터 유전자를 삽입하는 임의 전이가 발생한다.
  5. 일단 관심 유전자가 삽입되면 그것은 자체적인 P 트랜스포세스를 생산할 수 없기 때문에 더 이상 이동성이 없다.
  6. 파리를 기르고 십자가를 지어서 유기체의 세포들 사이의 유전적 변이를 제거하라.(유기체의 일부 세포만이 변형되었을 것이다. 바라건대, 이러한 변형된 세포들 중 일부는 결국 세균의 선에 들어가게 된다. 변형된 가메테는 세포 사이에 변화가 없는 유기체를 만들어 낼 것이다.)
  7. 리포터 유전자를 발현하는 파리를 찾아라. 이들은 삽입된 관심 유전자를 지니고 있으므로 관심 유전자에 의한 표현형을 결정하기 위해 조사할 수 있다.

삽입된 유전자는 숙주의 유전자 중 하나의 기능을 손상시켰을 수도 있다. 여러 줄의 파리가 필요하므로 비교가 가능하고 추가 유전자가 제거되지 않았는지 확인할 수 있다.

삽입성 돌연변이 유발

  1. 전이효소에 대한 DNA 코딩과 리포터 유전자와 전이효소 인식 시퀀스(그리고 종종 대장균 리포터 유전자와 복제의 기원 등)로 배아를 미세 주입한다.
  2. 리포터 유전자를 무작위로 삽입하는 임의 전이가 발생한다. 삽입은 활발하게 변형된 유전자 근처에서 일어나는 경향이 있는데, 이 부분이 염색질 구조가 가장 느슨한 곳이기 때문에 DNA가 가장 쉽게 접근할 수 있기 때문이다.
  3. 파리를 재배하고 교차시켜 유기체의 세포 사이의 유전적 변이를 제거한다(위 참조).
  4. 리포터 유전자를 발현하는 파리를 찾아라. 이들은 성공적인 전이 과정을 경험했기 때문에 기존 유전자의 돌연변이에 의한 표현형을 알아내기 위해 조사할 수 있다.

가능한 돌연변이:

  1. 번역된 부위에 삽입 => 하이브리드 단백질/트런 단백질. 더 복잡한 효과가 나타나기는 하지만, 대개 단백질 기능의 상실을 초래한다.
  2. 인트론에 삽입 => 변형된 스플리싱 패턴/스플리싱 실패. 비록 더 복잡한 효과는 흔하지만, 대개 단백질 잘림이나 비활동적인 잘못 쪼개진 제품의 생산을 초래한다.
  3. 5'에 삽입(mRNA 5' UTR이 될 시퀀스) 번역되지 않은 영역 => 대본 잘라내기. 일반적으로 mRNA가 5' 캡을 포함하지 못해 번역 효율이 떨어진다.
  4. 프로모터에 삽입 => 축소/완전한 표현 손실. 항상 단백질 생산량이 크게 감소한다. 상황의 단순성으로 인해 분석에 가장 유용한 유형의 삽입.
  5. 프로모터와 업스트림 엔핸서 사이의 삽입 => 리포터 유전자에 대한 엔핸서 함수의 손실/히잭 함수의 손실.③ 복합적인 효과가 나타나는 경우가 많지만 일반적으로 세포유형에 대한 단백질 특이성의 수준을 감소시킨다.
엔한서 트랩

다른 유전자에서 증류제를 납치하면 그 증류제의 기능을 분석할 수 있다. 이것은 특히 리포터 유전자가 형광성 단백질을 위한 것이라면 유기체를 통해 돌연변이 유전자의 표현을 지도화하는 데 도움을 줄 수 있으며, 매우 강력한 도구다. 유전자 발현 패턴(일시적, 공간적)을 살펴보는 데 유용한 도구다.

기타 사용법

이 방법들을 역유전학이라고 한다. 역유전학은 DNA 염기서열 분석으로 얻은 특정 유전자 염기서열의 표현형 효과를 분석하여 유전자의 기능을 발견하는 접근법이다.

돌연변이 유발 제품 분석

변이된 단백질의 기능이 결정되면 다음 방법으로 삽입 부위를 배열/정화/복제할 수 있다.

역 PCR

PCR에 의해 알려진 인서트를 측면으로 하는 DNA 분석 프로세스.
  1. 플라이 게놈을 격리시켜
  2. (기자 유전자를 자르지 않는 것으로 알려진 효소 [엔자임 1]을 사용하여) 가벼운 소화 과정을 거치며, 몇 킬로바이트의 파편과 삽입 및 옆구리 DNA를 투여한다.
  3. 삽입 및 측면 DNA가 있는 몇 개의 원형 DNA 파편을 선택할 수 있는 소생제(자체 내장을 보장하기 위한 낮은 DNA 농도)를 통해 소생제(자체 내장을 보장하기 위한 낮은 DNA 농도)를 조사한다.
  4. 리포터 유전자의 어느 지점에서 플라스미드를 절단한다(유전자 DNA에서는 매우 드물게 절단되는 것으로 알려진 효소 [엔자임 2]를 사용하지만 리포터 유전자에서 잘 알려져 있다).
  5. 리포터 유전자 부분의 프라이머를 사용하면 DNA를 증폭시켜 염기서열을 분석할 수 있다.

자르기, 자기배합, 재절단 과정을 통해 DNA의 옆구리 부위가 염기서열도 모른 채 증폭될 수 있다. 레깅이 발생한 지점은 [enzyme 1]의 절단 부지를 확인함으로써 알 수 있다.

플라스미드 구조

플라스미드 구조를 통해 알려진 삽입물에 대한 DNA 분석 프로세스.
  1. 플라이 게놈을 격리시켜
  2. 가벼운 소화(기자 유전자와 대장균 리포터 유전자 및 플라스미드 시퀀스 사이의 경계를 절단하는 것으로 알려진 효소 [엔자임 1]을 사용)를 통해 몇 킬로베이스의 파편, 대장균 리포터와 함께 몇 개, 플라스미드 시퀀스 및 그 옆구리 DNA를 투여한다.
  3. 자가 리깅을 위해 소화를 한다(자기 감시를 보장하기 위해 DNA 농도가 낮음). 원형 DNA 파편, 대장균 리포터, 플라스미드 시퀀스 및 그 옆구리 DNA를 선택할 수 있는 원형 DNA 조각들.
  4. 플라스미드를 대장균 세포에 삽입한다(예: 전기수술로).
  5. 대장균 선택 가능한 마커 유전자에 대한 플라스미드를 선택하십시오. 플라스미드 '하우스 키핑' 시퀀스를 가진 플라스미드를 성공적으로 삽입해야만 이 유전자를 표현할 수 있을 것이다.
  6. 그 유전자는 추가 분석을 위해 복제될 수 있다.

참조

  • 릴랜드 하트웰 외.. 2004. 유전학 - 유전자에서 게놈까지. 맥그로힐
  • 드로소필라의 엥겔스, W. R. P 원소
  1. ^ Majumdar, S; Rio, DC (April 2015). "P Transposable Elements in Drosophila and other Eukaryotic Organisms". Microbiology Spectrum. 3 (2): MDNA3–0004–2014. doi:10.1128/microbiolspec.MDNA3-0004-2014. PMC 4399808. PMID 26104714.
  2. ^ a b Griffiths, A. J. (2005). An introduction to genetic analysis. Macmillan.
  3. ^ Brennecke, J.; et al. (2008). "An epigenetic role for maternally inherited piRNAs in transposon silencing". Science. 322 (5906): 1387–1392. Bibcode:2008Sci...322.1387B. doi:10.1126/science.1165171. PMC 2805124. PMID 19039138.

외부 링크