마이크로 위성

Microsatellite

마이크로 위성(micro satellite)은 특정 DNA 모티브(1개부터 6개 이상의 염기쌍 길이 범위)가 일반적으로 5~[1][2]50회 반복되는 반복적인 DNA 영역이다.마이크로 위성들은 유기체의 게놈 안에 있는 수천 개의 위치에서 발생한다.그들은 높은 유전적 다양성을 초래하는 DNA의 다른[3] 영역보다 높은 돌연변이율을 가지고 있다.마이크로위성은 법의학 유전학자 및 유전계보학에서는 짧은 연속 반복(STRs) 또는 식물 유전학자에 [4]의해 단순 연속 반복(SSRs)으로 종종 언급된다.

마이크로 위성들과 그들의 더 긴 사촌인 미니 위성들은 함께 VNTR (가변적인 수의 연속 반복) DNA로 분류된다."위성" DNA라는 이름은 시험관에서 게놈 DNA의 원심 분리가 반복적인 [5]DNA의 "위성" 층과 함께 있는 부피 DNA 층을 분리한다는 초기 관찰을 의미한다.

그것들은 암 진단, 친족 분석(특히 친자확인 검사) 및 법의학적 식별에서 DNA 프로파일링에 널리 사용된다.그들은 또한 유전자 연결 분석에서 주어진 특성이나 질병에 책임이 있는 유전자나 돌연변이를 찾기 위해 사용된다.마이크로위성은 또한 아종, 집단, 개체 간의 연관성 수준을 측정하기 위해 개체 유전학에서 사용된다.

역사

최초의 마이크로위성은 1984년 레스터 대학에서 웰러, 제프리스 및 동료들에 의해 인간 미오글로빈 유전자의 다형성 GGAT 반복으로 특징지어졌지만, "마이크로 위성"이라는 용어는 1989년 Litt와 [1]Luty에 의해 도입되었다."위성" DNA라는 이름은 시험관에서 게놈 DNA의 원심 분리가 반복적인 [5]DNA의 "위성" 층과 함께 있는 부피 DNA 층을 분리한다는 초기 관찰을 의미한다.1990년대 초 PCR에 의한 DNA 증폭의 가용성의 증가는 법의학, 친자 검사, 그리고 특징이나 질병의 기초가 되는 유전자를 찾기 위한 위치 복제의 유전자 표지자로서 마이크로 위성 증폭을 사용하는 많은 연구를 촉발시켰다.초기 적용 사례로는 영국 살인 피해자의 8년 된 골격 유골(Hagelberg 등 1991년)과 제2차 세계대전 이후 남아메리카로 탈출한 아우슈비츠 강제 수용소 의사 요제프 멘겔레의 마이크로 위성 유전자형식이 있다(Jeffreys 등 1992년).[1]

구조, 위치 및 기능

마이크로 위성(micro satellite)은 길이가 1~6개 또는 최대 10개의 뉴클레오티드(정확한 정의와 묘사부터 [1][2]긴 미니 위성까지 저자에 따라 다름)에 걸쳐 연속적으로 반복되는 (인접한) DNA 모티브의 한 구역이며, 일반적으로 5~50회 반복된다.예를 들어 TATATATA 배열은 디뉴클레오티드 마이크로위성, GTCGTCGTCGTCGTC는 트리뉴클레오티드 마이크로위성(A는 아데닌, G구아닌, C 사이토신T티민)이다.4개의 뉴클레오티드와 5개의 뉴클레오티드의 반복 단위를 각각 테트라 및 펜타뉴클레오티드 모티브라고 한다.대부분의 진핵생물들은 일부 효모종을 제외하고 마이크로위성을 가지고 있다.마이크로 위성들은 [6][1][7]게놈 전체에 분포되어 있다.예를 들어 인간 게놈은 50,000~100,000개의 디뉴클레오티드 마이크로 위성 및 더 적은 수의 트라이, 테트라, 펜타뉴클레오티드 마이크로 [8]위성들을 포함한다.많은 것들이 인간 게놈의 코드화되지 않은 부분에 위치하기 때문에 단백질을 생산하지 않지만, 조절 영역과 코드화 영역에도 위치할 수 있다.

비코드 영역의 마이크로 위성에는 특정 기능이 없을 수 있으므로 이에 대해 선택되지 않을 수 있습니다. 따라서 여러 세대에 걸쳐 방해받지 않고 돌연변이를 축적할 수 있으며 DNA 지문 채취 및 식별 목적으로 사용될 수 있는 가변성을 발생시킬 수 있습니다.다른 마이크로 위성들은 유전자의 조절 측면 또는 인트로닉 영역 또는 유전자의 코돈에 직접 위치해 있다. 이러한 경우 마이크로 위성 돌연변이는 표현형 변화와 질병, 특히 연약한 X 증후군이나 헌팅턴병과 [9]같은 삼중항 확장 질환으로 이어질 수 있다.

텔로미어는 염색체의 맨 끝에 위치하는 DNA의 선형 배열로, "말단 복제 문제"[2]로 인한 연속적인 세포 분열 동안 게놈 물질의 무결성을 보호한다.백혈구에서 텔로미어 DNA의 점진적인 단축은 여러 [10]샘플 유형에서 노화와 반비례하는 것으로 나타났다.텔로미어는 척추동물에서 [citation needed]헥사뉴클레오티드 반복 모티브 TTAGGG와 함께 반복 DNA로 구성됩니다.따라서 그것들은 미니 위성들로 분류된다.마찬가지로, 곤충들은 마이크로 [citation needed]위성으로 간주될 수 있는 텔로미어에 짧은 반복 모티브를 가지고 있다.

돌연변이 메커니즘 및 돌연변이율

STR 궤적을 복제하는 동안 DNA 가닥이 빠집니다.상자는 반복적인 DNA 단위를 상징합니다.화살표는 새 DNA 가닥(흰색 상자)이 템플릿 가닥(검은 상자)에서 복제되는 방향을 나타냅니다.(a) STR 궤적의 복제는 돌연변이 없이 3가지 상황을 나타낸다. (b) STR 궤적의 복제는 새로운 가닥의 루프에 의해 1유닛의 이득을 가져왔다. (c) 반대쪽 가닥에 상보적인 측면 유닛에 의해 이상 루프가 안정화된다. (c) STR 궤적의 복제는 t를 이끌었다.o 템플릿 가닥의 루프로 인한 단위 1개 손실. (Forster et al. 2015)

단일 뉴클레오티드에만 영향을 미치는 점 돌연변이와 달리, 마이크로 위성 돌연변이는 전체 반복 단위의 득실을 가져오고, 때로는 두 개 이상의 반복을 동시에 일으킨다.따라서, 마이크로 위성 위치에서의 돌연변이율은 기저 치환율과 같은 다른 돌연변이율과 다를 것으로 예상된다.마이크로위성 돌연변이의 실제 원인은 논의되고 있다.

이러한 길이 변화의 한 가지 제안된 원인은 감수 분열 [11]중에 복제되는 동안 DNA 가닥 간의 불일치로 인해 발생하는 복제 미끄러짐이다.복제하는 동안 DNA를 읽는 데 책임이 있는 효소인 DNA 중합효소는 템플릿 가닥을 따라 이동하는 동안 미끄러져 잘못된 뉴클레오티드에서 지속될 수 있습니다.DNA 중합효소 미끄러짐은 반복 배열(예: CGCGCG)이 복제될 때 발생할 가능성이 더 높다.마이크로 위성들은 이러한 반복적인 배열로 구성되기 때문에, DNA 중합효소는 이러한 배열 영역에서 더 높은 속도로 오류를 일으킬 수 있습니다.몇몇 연구는 미끄러짐이 마이크로 위성 [12][13]돌연변이의 원인이라는 증거를 발견했다.일반적으로 각 마이크로 위성에서의 미끄러짐은 약 1,000 [14]세대 당 한 번 발생한다.따라서,[15] 반복적인 DNA의 미끄러짐 변화는 게놈의 다른 부분의 점 돌연변이보다 3단계 더 흔하다.대부분의 미끄러짐은 하나의 반복 단위만 변화하며, 미끄러짐 속도는 다른 대립 유전자 길이와 반복 단위 [3]크기에 따라, 그리고 다른 [16]종에 따라 달라진다.개별 대립 유전자 사이에 큰 크기 차이가 있으면 감수 분열 [15]시 재조합 시 불안정성이 증가할 수 있다.

마이크로 위성 돌연변이의 또 다른 가능한 원인은 복제 중에 하나의 뉴클레오티드만 잘못 복사되는 점 돌연변이입니다.인간과 영장류 게놈을 비교한 연구는 짧은 마이크로 위성에서 반복 횟수의 변화는 대부분 [17]미끄러짐보다는 점 돌연변이에 의해 나타난다는 것을 발견했다.

마이크로 위성 돌연변이율

마이크로 위성 돌연변이율은 마이크로 위성, 반복 유형 및 베이스 [17]ID에 상대적인 베이스 위치에 따라 달라집니다.돌연변이율은 반복 횟수에 따라 증가하며, 약 6~8회 반복 횟수에 도달한 후 다시 [17]감소합니다.집단에서 헤테로 접합성이 증가하면 특히 대립 유전자 사이에 큰 길이 차이가 있을 때 마이크로 위성 돌연변이율도 [18]증가할 것이다.이것은 길이가 [19]일정하지 않은 상동 염색체 때문에 감수분열 중에 불안정할 수 있다.

마이크로 위성 돌연변이율에 대한 직접적인 추정은 곤충에서 인간에 이르기까지 수많은 유기체에서 이루어졌다.사막 메뚜기 슈스토세르카 그레가리아에서 마이크로 위성 돌연변이율은 [20]궤적당 세대당 2.1 x 10으로−4 추정됐다.인간 남성 생식선의 마이크로 위성 돌연변이율은 여성 생식선보다 5~6배 높으며 [3]세대당 생식체 당 궤적당 0~7×10이다−3.선충인 프리스티온쿠스 퍼시픽에서 추정된 마이크로 위성 돌연변이율은 [21]세대당 궤적당 8.9 × 10−5 ~ 7.5 × 10이다−4.

마이크로위성 돌연변이의 생물학적 영향

많은 미세 위성들은 코드화되지 않은 DNA에 위치해 있고 생물학적으로 조용하다.다른 것들은 규제 또는 코드 DNA에 위치해 있다 – 그러한 경우 마이크로 위성 돌연변이는 표현형 변화와 질병을 초래할 수 있다.게놈 전체에 걸친 연구는 마이크로 위성 변화가 인간의 [22]유전 유전자 발현 변동의 10-15%에 기여한다고 추정한다.

단백질에 미치는 영향

포유동물에서 단백질의 20~40%는 짧은 염기서열 [23]반복에 의해 코드된 아미노산의 반복서열을 포함한다.게놈의 단백질 코드 부분 내에서 반복되는 짧은 배열의 대부분은 세 개의 뉴클레오티드의 반복 단위를 가지고 있는데, 그 길이는 돌연변이 [24]시 프레임 변화를 일으키지 않을 것이기 때문이다.각 트리뉴클레오티드 반복배열은 동일한 아미노산의 반복계열에 전사된다.효모에서 가장 흔한 반복 아미노산은 글루타민, 글루탐산, 아스파라긴, 아스파라긴산, 세린이다.

이러한 반복 세그먼트의 돌연변이는 단백질의 물리적, 화학적 특성에 영향을 미칠 수 있으며, 단백질 [25]작용에 점진적이고 예측 가능한 변화를 일으킬 수 있습니다.예를 들어 Runx2 유전자의 연속 반복 영역의 길이 변화는 길어진 배열 길이와 긴 [26]얼굴 사이의 연관성과 함께 길어진 개(Canis adviousis)의 얼굴 길이 차이를 초래한다.이 연관성은 더 광범위한 카르니보라 [27]종에도 적용된다.HoxA13 유전자 내 폴리알라닌 세포의 길이 변화는 인간의 [28]발달 장애인 손발 유전자 증후군과 관련이 있다.다른 세쌍둥이 반복의 길이 변화는 인간의 40개 이상의 신경학적 질병, 특히 연약한 X 증후군이나 [9]헌팅턴병과 같은 세쌍둥이 확장 질환과 관련이 있다.복제 슬립으로 인한 진화적 변화는 더 단순한 유기체에서도 일어난다.예를 들어, 미세 위성 길이 변화는 효모의 표면막 단백질 내에서 공통적으로 발생하며, 세포 [29]성질에 빠른 진화를 제공한다.구체적으로는 FLO1 유전자의 길이 변화가 [30]기질과의 접착 수준을 제어한다.짧은 염기서열 반복은 또한 파테노제닉 박테리아에서 표면 단백질에 빠른 진화적 변화를 제공한다; 이것은 그들이 [31]숙주의 면역학적 변화를 따라갈 수 있게 할 수 있다.곰팡이(Neurospora crassa)에서 짧은 시퀀스의 반복 길이 변화는 균주의 시계 [32]주기의 지속 시간을 제어합니다.

유전자 조절에 미치는 영향

촉진제 및 다른 시스 조절 영역 내 마이크로 위성들의 길이 변화는 세대 간에 유전자 발현을 빠르게 변화시킬 수 있다.인간 게놈은 조절 영역에 수많은 짧은 염기서열 반복(1만6천 개 이상)을 포함하고 있어 많은 유전자의 발현을 [22][33]조절하는 '조절 손잡이'를 제공한다.

박테리아 SSR의 길이 변화는 프로모터 [31]간격을 변경함으로써 Hemophilus influencefimbriae 형성에 영향을 미칠 수 있다.디뉴클레오티드 마이크로 위성들은 인간 [33]게놈에서 시스 조절 제어 영역의 풍부한 변화와 연관되어 있다.vasopressin 1a 수용체 유전자의 제어 영역에 있는 마이크로 위성들은 그들의 사회적 행동과 일부일처제 [34]수준에 영향을 미친다.

유잉의 육종에서 점 돌연변이는 전사인자를 결합하는 확장된 GGAA 마이크로위성을 만들어 [35]암을 이끄는 EGR2 유전자를 활성화시켰다.또한, 다른 GGAA 마이크로 위성들은 유잉 육종 환자의 [36]임상 결과에 기여하는 유전자의 발현에 영향을 미칠 수 있다.

인트론 내에서의 영향

인트론 내의 마이크로 위성 또한 현재 이해되지 않는 수단을 통해 표현형에 영향을 미친다.예를 들어 X25 유전자의 첫 번째 인트론에서 GAA 세쌍의 팽창은 전사를 방해하는 것으로 보여 프리드라이히 아탁시아를 [37]일으킨다.아스파라긴 합성효소 유전자의 첫 번째 인트론에서 탠덤 반복은 급성 림프아구성 [38]백혈병과 관련이 있다.NOS3 유전자의 제4 인트론에서의 반복 다형성은 튀니지 [39]인구의 고혈압과 관련된다.EGFR 유전자의 감소된 반복 길이는 골육종과 [40]관련이 있다.

Zebrafish에 보존된 오래된 형태의 스플라이싱은 U2AF2 및 기타 스플라이싱 기계가 없을 때 인트로닉 mRNA 내의 마이크로 위성 시퀀스를 사용하여 인트로닉 mRNA를 제거하는 것으로 알려져 있습니다.이러한 배열은 3'와 5'의 인트론 스플라이스 부위를 근접하게 하여 스플라이스솜을 효과적으로 대체하는 매우 안정적인 클로버 리프 구성을 형성한다는 이론이 있다.이 RNA 스플라이싱 방법은 네발동물의 형성에 따른 인간의 진화에서 벗어나 RNA [41]세계의 인공물을 나타내는 것으로 알려져 있다.

트랜스포존 내에서의 영향

인간 게놈의 거의 50%는 다양한 종류의 트랜스포저블 요소(트랜스포존 또는 '점핑 유전자'라고도 함)에 포함되어 있으며, 그들 중 다수는 반복적인 [42]DNA를 포함하고 있다.이러한 위치에서 짧은 염기서열 반복이 유전자 [43]발현 조절에도 관여할 가능성이 있다.

적용들

마이크로 위성들은 암 진단에서 염색체 DNA 결실을 평가하기 위해 사용된다.마이크로위성은 DNA 프로파일링(유전자 지문 채취)에 널리 사용되며, 범죄 흔적(과학 수사) 및 조직(이식 환자)에 사용됩니다.또한 친족관계 분석(친자확인 테스트에서 가장 일반적으로 사용됨)에도 널리 사용됩니다.또한 마이크로위성은 게놈 내의 위치를 매핑하는데 사용되며, 특히 특정 특성 또는 질병에 책임이 있는 유전자 또는 돌연변이를 찾기 위한 유전자 연결 분석에서 사용된다.매핑의 특별한 경우로서, 그것들은 유전자 복제 또는 결실의 연구에 사용될 수 있다.연구자들은 개체 유전학과 종 보존 프로젝트에서 마이크로 위성을 사용한다.식물 유전학자들은 식물 육종에서 바람직한 특징의 선택을 위해 마이크로 위성을 사용할 것을 제안했다.

암 진단

복제에 대한 제어가 손상된 종양 세포에서 마이크로 위성은 각 유사분열 동안 특히 높은 빈도로 획득되거나 손실될 수 있다.따라서 종양 세포주는 숙주 조직과 다른 유전자 지문을 보일 수 있으며, 특히 대장암에서 이형 접합의 상실을 나타낼 수 있다.따라서 암 진단에서 종양 [44][45][46]진행을 평가하기 위해 마이크로 위성이 일상적으로 사용되어 왔다.

Applied Biosystems Identifiler 키트를 사용하여 얻은 부분 인간 STR 프로파일

법의학 및 의료용 지문 채취

마이크로 위성 분석은 1990년대에 [47]법의학 분야에서 인기를 끌었다.법의학적 식별이 가능한 개인의 유전자 지문 채취에 사용됩니다(일반적으로 범죄 얼룩을 피해자 또는 가해자와 일치시킵니다).골수이식 환자 [48]추적에도 사용된다.

오늘날 법의학 분석에 사용되는 마이크로 위성들은 모두 테트라 또는 펜타뉴클레오티드 반복으로, 이상적이지 않은 조건에서 열화에서 살아남을 수 있을 만큼 충분히 짧으면서도 높은 수준의 무오차 데이터를 제공하기 때문이다.짧은 반복 시퀀스는 PCR 스태터 및 우선 증폭과 같은 아티팩트에 시달리는 경향이 있으며, 긴 반복 시퀀스는 환경 열화에 더 큰 영향을 받고 PCR에 [49]의해 잘 증폭되지 않습니다.또 다른 법의학적 고려사항은 개인의 의료 프라이버시가 존중되어야 한다는 것이다. 그래서 법의학 STR은 비암호화이고 유전자 조절에 영향을 미치지 않으며 헌팅턴병과 같은 삼중항 확장 질환에 관여할 수 있는 보통 트리뉴클레오티드 STR이 아니다.법의학 STR 프로파일은 UK National DNA Database(NDNAD), American CODIS 또는 Australian NCIDD와 같은 DNA 데이터뱅크에 저장됩니다.

친족관계 분석(자녀관계 테스트)

상염색체 마이크로 위성은 친족 분석에서 DNA 프로파일링을 위해 널리 사용된다(가장 일반적으로 친자확인 테스트에서).[50]아버지 유전인 Y-STR(Y 염색체의 마이크로 위성)은 종종 계보 DNA 테스트에 사용된다.

유전자 연계 분석

1990년대와 이번 천년의 첫 몇 년 동안, 마이크로위성은 표본 혈통 세대에 걸친 분리 관찰을 사용하여 주어진 표현형이나 질병의 원인이 되는 유전자를 찾기 위한 게놈 전체의 스캔에 있어 중요한 유전자 지표였다.높은 처리량과 비용 효율적인 단일다형성(SNP) 플랫폼의 증가로 게놈 스캔을 위한 SNP 시대가 열렸지만, 마이크로 위성은 연결 및 연관 연구를 위한 게놈 변이의 매우 유용한 척도로 남아 있다.이들의 지속적인 장점은 바이알릴 SNP보다 더 큰 대립 유전자의 다양성에 있다. 따라서 마이크로위성은 관심 있는 SNP 정의 연결 불균형 블록 내에서 대립 유전자를 구별할 수 있다.따라서 마이크로위성은 제2형 당뇨병(TCF7L2)과 전립선암 유전자(8q21 영역)[2][51]의 발견으로 이어졌다.

집단유전학

인류 249마리와 침팬지 6마리로 이루어진 합의된 이웃 나무.246개의 마이크로 위성 [52]마커를 기반으로 작성되었습니다.

마이크로 위성들은 1990년대 동안 인구 유전학에서 대중화되었는데, 는 PCR이 실험실에서 보편화되면서 연구원들이 저렴한 비용으로 프라이머를 설계하고 마이크로 위성 세트를 증폭시킬 수 있었기 때문이다.그 용도는 [53]광범위하다.중성진화이력을 가진 마이크로위성은 병목,[54] 국소적응,[55] 대립고정지수(FST),[56] 모집단 크기 [57]유전자 [58]흐름을 측정 또는 추론하는데 적용할 수 있게 한다.차세대 시퀀싱이 보다 저렴해짐에 따라 마이크로 위성 사용은 감소했지만,[59] 이 분야에서는 여전히 중요한 도구입니다.

식물 육종

마커 보조 선택 또는 마커 보조 선택(MAS)은 특성 자체보다는 관심 특성(예: 생산성, 질병 내성, 스트레스 내성 및 품질)에 연결된 마커(모형학적, 생화학 또는 DNA/RNA 변화)에 기반하여 관심 특성이 선택되는 간접 선택 과정이다.초소형 위성은 식물의 [60]번식을 돕기 위해 그러한 표식으로 사용되어야 한다고 제안되어 왔다.

분석.

반복 DNA는 호모폴리머 작용과 씨름하는 차세대 DNA 배열 방법으로는 쉽게 분석되지 않는다.따라서 마이크로 위성들은 일반적으로 기존의 PCR 증폭과 앰프콘 크기 결정에 의해 분석되며, 때로는 생거 DNA 염기서열처리에 따라 분석되기도 한다.

포렌식에서는 시료의 세포에서 핵DNA를 추출한 후 중합효소 연쇄반응에 의해 추출된 DNA의 특정 다형성 영역을 증폭함으로써 분석을 실시한다.이러한 시퀀스가 증폭되면 전기영동 또는 모세관 전기영동통해 해결되며, 이를 통해 분석가는 문제의 마이크로 위성 시퀀스의 반복 횟수를 결정할 수 있습니다.DNA가 겔 전기영동에 의해 분해된 경우, DNA는 은 염색(저감도, 안전, 저렴한 가격) 또는 브롬화 에티듐과 같은 중간 염료(상당히 민감하고 적당한 건강 위험, 저렴한 가격) 또는 대부분의 현대 법의학 연구소가 사용하는 형광 염료(고감도, 안전, 비싼 가격)[61]로 시각화할 수 있다.모세관 전기영동에 의해 마이크로 위성 파편을 분해하기 위해 만들어진 기구들도 형광 [61]염료를 사용한다.법의학 프로파일은 주요 데이터뱅크에 저장됩니다.마이크로 위성 위치 식별을 위한 영국의 데이터베이스는 원래 10개의 위치 및 성표지를 사용하는 영국 SGM[62][63]+ 시스템을 기반으로 했다.미국인들은[64] 이 숫자를 13로키로 [65]늘렸다.호주의 데이터베이스는 NCIDD라고 불리며, 2013년부터 DNA [47]프로파일링을 위해 18개의 핵심 마커를 사용해 왔다.

증폭

마이크로위성들은 측면 영역의 고유한 염기서열을 프라이머로 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR) 과정을 통해 식별을 위해 증폭될 수 있다.DNA를 고온에서 반복적으로 변성시켜 이중 가닥을 분리한 후 프라이머의 아닐과 마이크로위성에서의 뉴클레오티드 배열의 연장이 가능하도록 냉각한다.이 과정은 아가로스폴리아크릴아미드겔에서 볼 수 있을 만큼 충분한 DNA를 생산하게 됩니다; 이러한 방식으로 열순환이 복제된 [66]세그먼트에서 기하급수적인 증가를 만들기 때문에 증폭에 필요한 DNA는 소량뿐입니다.풍부한 PCR 테크놀로지로 마이크로 위성 궤적을 따라가는 프라이머는 간단하고 빠르게 사용할 수 있지만 올바르게 기능하는 프라이머의 개발은 지루하고 비용이 많이 드는 프로세스인 경우가 많습니다.

Littorina Plena 샘플의 다수의 DNA 샘플은 가변 단순 배열 반복(SSR, a.k.a. micro satellite) 궤적을 대상으로 한 프라이머와 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 증폭되었다.샘플은 5% 폴리아크릴아미드 겔에서 실행되었으며 은색 염색을 사용하여 시각화되었습니다.

마이크로위성 프라이머 설계

예를 들어 특정 인트론 내에서 게놈의 특정 영역에서 마이크로 위성 마커를 검색하는 경우 프라이머를 수동으로 설계할 수 있습니다.이것은 마이크로 위성 반복을 위한 게놈 DNA 염기서열을 검색하는 것을 포함합니다. 이것은 눈으로 또는 반복 마스커와 같은 자동화된 도구를 사용하여 수행될 수 있습니다.잠재적으로 유용한 마이크로 위성들이 결정되면, 플랭크 배열은 PCR 반응에서 특정 마이크로 위성 반복을 증폭시키는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하기 위해 사용될 수 있다.

랜덤 마이크로 위성 프라이머는 국소 종에서 DNA의 랜덤 세그먼트를 복제함으로써 개발될 수 있다.이러한 랜덤 세그먼트는 플라스미드 또는 박테리오파지 벡터에 삽입되어 대장균에 이식됩니다.그런 다음 집락을 개발하고 형광 라벨이 부착된 올리고뉴클레오티드 배열로 선별하여 DNA 세그먼트에 존재하는 경우 마이크로 위성 반복으로 교배한다.이 절차에서 양성 클론을 얻을 수 있는 경우에는 DNA를 배열하고 이러한 영역에 인접한 배열에서 PCR 프라이머를 선택하여 특정 궤적을 결정한다.이 과정은 마이크로 위성 반복 시퀀스를 예측해야 하고 무작위로 분리된 프라이머가 유의한 [15][67]다형성을 나타내지 않을 수 있기 때문에 연구원들의 상당한 시행착오를 수반한다.필요한 것은 PCR을 통한 증폭에 적합한 기질이기 때문에 마이크로위성 자리는 게놈 전체에 널리 분포되어 있으며 오래된 검체의 반분해 DNA로부터 분리될 수 있다.

보다 최근의 기술은 추출된 DNA를 "농축"하기 위해 마이크로위성에서의 반복을 보완하는 반복으로 구성된 올리고뉴클레오티드 염기서열을 사용하는 것을 포함한다.올리고뉴클레오티드 프로브는 마이크로위성에서의 반복과 교배하여 프로브/마이크로위성 복합체를 용액에서 꺼낸다.농축된 DNA는 정상적으로 복제되지만, 이제 성공 비율은 훨씬 더 높아져 사용할 영역을 개발하는 데 필요한 시간을 대폭 줄일 수 있습니다.단, 어떤 프로브를 사용할지는 그 [68]자체로 시행착오 프로세스가 될 수 있습니다.

ISSR-PCR

ISSR(단순간 배열 반복을 위한)은 마이크로 위성 위치 사이의 게놈 영역을 총칭하는 용어이다.인접한 2개의 마이크로 위성과의 상보적 시퀀스는 PCR 프라이머로 사용되며, 이들 사이의 가변 영역은 증폭됩니다.PCR 중 증폭 주기의 제한된 길이는 지나치게 긴 연속 DNA 배열의 과도한 복제를 방지하므로, 그 결과는 일반적으로 짧지만 길이가 많이 다른 다양한 증폭 DNA 가닥의 혼합이 될 것이다.

ISSR-PCR에 의해 증폭된 배열을 DNA 지문 채취에 사용할 수 있다.ISSR은 보존 또는 비관찰 영역일 수 있으므로, 이 기술은 개인을 구별하는 데 유용하지 않고, 계통지리학적 분석이나 종(種)을 구분하는 데 유용하며, 배열 다양성은 SSR-PCR보다 낮지만, 실제 유전자 배열보다는 여전히 높다.또, 마이크로 위성 시퀀싱과 ISSR 시퀀싱은, 한쪽이 다른 한쪽의 프라이머를 생성하기 때문에, 상호 도움이 된다.

제한 사항

반복 DNA는 호모폴리머 작용과 [69]씨름하는 차세대 DNA 배열 방법으로는 쉽게 분석되지 않는다.따라서 마이크로 위성들은 일반적으로 기존의 PCR 증폭 및 앰프 아이콘 크기 결정에 의해 분석된다.PCR의 사용은 마이크로 위성 길이 분석이 다른 PCR 증폭 DNA 궤적처럼 PCR 제한에 노출되기 쉽다는 것을 의미한다.특히 우려되는 것은 ' 대립 유전자'의 발생입니다.

  • 간혹 친자확인 사례와 같은 개인의 표본 내에서 마이크로위성 옆쪽 DNA의 돌연변이는 PCR 프라이머가 결합 및 생성되는 것을 막을 수 있으며(겔 분석에서 "늘 대립 유전자"를 생성함), 따라서 단 하나의 대립 유전자만 증폭되며(변성되지 않은 자매 염색체로부터) 개체는 쓰러질 수 있다.동종 접합으로 보입니다이것은 친자확인 사례에 혼란을 일으킬 수 있다.그런 다음 다른 프라이머 [15][70]세트를 사용하여 마이크로 위성 증폭이 필요할 수 있습니다.눌 대립 유전자는 특히 확장이 시작되는 3' 부분의 돌연변이에 의해 발생합니다.
  • 예를 들어, 보존 작업에서의 종 또는 개체군 분석에서, 한 개인 또는 종에서 마이크로 위성을 증폭시키는 PCR 프라이머는 다른 종에서 작동할 수 있다.그러나 PCR 프라이머를 여러 종에 걸쳐 적용하는 위험은 염기서열 차이가 너무 커서 프라이머가 결합할 수 없을 때 늘 대립 유전자가 발생할 가능성이 높다는 것이다.그러면 그 종은 인위적으로 줄어든 다양성을 가진 것처럼 보일 수 있다.이 경우 늘 대립 유전자는 때때로 하디-바인버그 평형 기대에서 벗어난 호모 접합자의 과도한 빈도로 나타날 수 있다.

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